بهبود روشهای بیولوژیکی تولید سورفکتانت های میکروبی (کاربردی در ازدیاد برداشت از مخازن نفتی)

رامنولیپیدها که توسط باکتریها ی بیماریزای انسانی فرصت طلب (سودوموناس ارژینوزا) تولید می شوند، به علت قابلیت استفاده در صنایع مختلف از جمله داروسازی، کشاورزی، صنایع غذایی، زیست پالایی و نفت، به عنوان نسل بعدی سورفکتانت های تجاری مطرح می باشند. تجاری سازی و تولید صنعتی این محصولات با ارزش، نیازمند توسعه و بهینه سازی در زمینه های مختلف از قبیل مهندسی متابولیک، طراحی محیط کشت، استراتژی های عملیاتی متعدد، و خالص سازی محصولات می باشد. تحقیق حاضر در دو بخش اصلی آزمایشگاهی (بیوتکنولوژی مولکولی و دست ورزی ژنتیکی) و شبیه سازی رایانه ای (زیست شناسی سامانه ای و طراحی سویه ی in silico) صورت گرفت. در بخش نخست این تحقیق، ژن های rhlab (ژنهای مربوط به تولید رامنولیپید) از سویه ای از سودوموناس ارژینوزا (atcc 9027) که تولید کننده ی مونو رامنولیپیدها می باشد جدا شد و در سویه ای از سودوموناس پوتیدا (kt2440) به عنوان میزبانی غیر بیماریزا و مناسب وارد گردید. سپس قابلیت سویه نوترکیب مذکور در محیط های کشت مختلف بررسی شد. به عنوان پیش نیاز طراحی محیط کشت بهینه، مجموعه ای از 32 آزمایش در دو مرحله صورت پذیرفت تا تعدادی از مواد مغذی جهت تولید رامنولیپیدها توسط سویه نوترکیب حاصل مورد ارزیابی قرار گیرند. در مرحله ی ابتدایی آزمایشهای غربالگری، از روش فاکتوریل جزئی دو سطحی جهت ارزیابی اثر 8 ماده مغذی (شامل منابع مختلف کربن، نیتروژن و فسفر) بهره گرفته شد و در مرحله دوم، روش فاکتوریل کلی جهت مطالعه 4 ماده مغذی انتخاب شده از مرحله نخست مورد استفاده قرار گرفت. بر اساس روش دو مرحله ای اعمال شده، گلیسیرول، عصاره مخمر و پپتون تأثیرات مثبت معنی دار و قابل توجهی بر تولید رامنولیپید نوترکیب داشته در حالی که فاکتورهای متقابل عصاره مخمر/پپتون و گلیسیرول/عصاره مخمر/پپتون اثر منفی معنی داری بر پاسخ مورد نظر داشته اند. دامنه وسیع اختلافات مشاهده شده در میزان تولید رامنولیپید نوترکیب از صفر تا mg/l 570 در محیط های کشت مربوطه در طول آزمایشهای غربالگری، بیانگر اهمیت بهینه سازی ترکیب محیط کشت می باشد. به عنوان مرحله تکمیلی، سری آزمایشهای جدیدی بر اساس طراحی نسبت مواد مغذی در محیط کشت و همچنین بررسی اثر فاکتور عملیاتی زمان تزریق ماده محرک (iptg) به محیط کشت صورت پذیرفت. بر اساس نتایج بدست آمده مشخص شد که گلیسیرول در حضور مقدار کمی از مواد مغذی دیگر (عصاره مخمر و پپتون)، تأثیر قابل توجهی بر تولید رامنولیپید نوترکیب داشته است. بالاترین مقدار تولیدی در سری آزمایشهای تکمیلی، معادل mg/l 925 بود که حدوداً 62% بیشتر از بهترین نتیجه حاصل در آزمایشهای غربالگری است. با اینحال، با توجه به این نکته که دو پیش ماده اصلی تولید رامنولیپیدها (d-glucose-6-phasphate و haa) مستقیماً از متابولیسم مرکزی نشأت می گیرند، جهت افزایش میزان بهره دهی، نیازمند مهندسی متابولیک و دست ورزی ژنتیکی خواهیم بود. از اینرو، به عنوان بخش دوم تحقیق، امکان افزایش بهره تولید رامنولیپید نوترکیب بر اساس زیست شناسی سامانه ای (systems biology) و با استفاده از مدلهای بازسازی شده ژنوم-مقیاس مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل به خوبی نشان داد که بر خلاف سویه ی اصلی (سودوموناس ارژینوزا)، از نقطه نظر تئوری تولید رامنولیپید بصورت وابسته به رشد و با بازدهی نسبتاً بالا در سویه نوترکیب سودوموناس پوتیدا امکان پذیر می باشد. این واقعیت امکان تولید این دسته از سورفکتانت های ارزشمند را از طریق فرآیندهایی توسعه یافته تر و موثرتر فراهم خواهد آورد.